emecebe reloaded

Bine ai venit la EMCB
24.11.2017, 09:22

Activarea limfocitelor T - rolul moleculelor adaptator

ImunologieC. Bara*

Activarea limfocitelor T (LT) reprezinta momentul central al majoritatii raspunsurilor imune, ele fiind raspunsuri, care se realizeaza pe baza unei cooperari celulare, la care este absolut necesara prezenta LT (in principal helper). Activarea LT poate avea loc, insa, numai daca sunt indeplinite anumite conditii:
a) sa fie activate de antigene T-dependente;
b) activarea lor sa aiba loc in cadrul unei cooperari celulare, la care sa participe celulele prezentatoare de antigen (APC); acestea - spre deosebire de LT - dispun pe membranele lor de receptori de captare a antigenelor opsonizate (CR si FcgR) si de un echipament enzimatic adecvat procesarii acestora; activarea LT se realizeaza astfel pe o cale ocolita, care implica captarea antigenelor de catre APC si prezentarea unor fragmente (rezultate din procesarea acestora) pe membranele lor in complex cu moleculele MHC catre LT;
c) pentru a se atinge un nivel adecvat de activare a LT, cooperarea APC-LT trebuie sa fie bidirectionala, respectiv, cele 2 celule trebuie sa se activeze reciproc. In functie de sensul, in care se realizeaza, aceasta cooperare este de 2 tipuri: anterograda si retrograda.
Cooperarea anterograda se exercita dinspre APC catre limfocitul T, adica in aceeasi directie cu sensul prezentarii antigenice. Activarea limfocitului T se realizeaza prin transmiterea unor semnale activatoare catre profunzimea citoplasmei acestuia pe 2 cai distincte. Transductia semnalelor pe calea TCR-CD3 (calea principala) se soldeaza cu activarea metabolica si stimularea diviziunilor celulare (expansiunea clonala), pe cand transductia semnalelor pe calea CD28 (calea secundara) se soldeaza cu stimularea functiilor efectorii ale limfocitelor T, ele devenind producatoare fie de interleukine (limfocitele TH), fie de mediatori cu rol distructiv (limfocitele TC).
Cooperarea retrograda se exercita dinspre limfocitul T activat catre APC, se exercita in sens opus prezentarii antigenice si se realizeaza prin elaborarea si eliberarea de catre limfocitul T a IL4 si/sau IFNg, care - printre alte actiuni - stimuleaza expresia pe membranele APC a moleculelor MHCII, ceea ce implicit conduce si la cresterea capacitatii de prezentare a antigenului. Expunerea unor cantitati suplimentare de antigen (Ag) contribuie la stimularea suplimentara a LT, care - la randul lui - poate stimula in sens retrograd si mai mult APC etc., pana cand - cele 2 celule activandu-se reciproc - este posibila atingerea si chiar depasirea "pragului" declansarii raspunsului imun. La scara de organ limfoid, de principiu, declansarea raspunsului imun poate avea loc in mod eficient, atunci cand limfocitele T stimulate antigenic in cadrul cooperarii lor cu APC, sunt activate metabolic, sunt mai numeroase si, in fine, sunt pe cale de a-si definitiva maturarea.
Activarea in sens anterograd a LT parcurge invariabil 2 etape distincte, prima fiind etapa Ag-independenta si a doua etapa Ag-dependenta.
In cursul etapei Ag-independente, se stabilesc contacte intime si pe suprafete intinse intre membranele APC si LT, ca urmare a angajarii - intre cele 2 celule - de legaturi prin intermediul cuplurilor de adeziune intercelulara. Primele care apar sunt realizate prin cuplul de adeziune intercelulara de linia I, care este reprezentat de CD2 (LT) si LFA3 (APC). Acestea sunt primele legaturi, care se constituie, intrucat cei 2 liganzi au o foarte mare afinitate unul fata de celalalt. Ulterior, intre cele 2 celule incep sa se stabileasca legaturi si prin cuplul de adeziune intercelulara de linia II, reprezentat de LFA1 (LT) si ICAM (APC). Aceste legaturi se stabilesc mai tarziu, intrucat cei 2 liganzi au o afinitate reciproca mai redusa. Contactele realizate prin CD2/LFA3 si LFA1/ICAM sunt numite contacte Ag-nespecifice, intrucat aceste legaturi se realizeaza prin participarea acelorasi receptori de adeziune, indiferent de specificitatea Ag sau daca acesta este sau nu prezentat pe membranele APC. Desi are caracter nespecific, aceasta prima faza este extrem de importanta, intrucat ea favorizeaza prezentarea si recunoasterea antigenica: acolarea pe suprafete intinse a membranelor celulare face posibila stabilirea de legaturi intre complexul MHC/epitop si TCR, aceste molecule difuzand lateral in membranele celulare pana in momentul in care ele vin fata in fata si are loc deci recunoasterea antigenica. In plus, aceasta etapa conteaza, de asemenea, si pentru pregatirea activarii limfocitului T. Etapa Ag-nespecifica are loc in permanenta, adica si atunci cand APC nu expun nici un Ag, dar si atunci cand acestea expun Ag, dar acestea nu au fost inca recunoscute de catre TCR; cu alte cuvinte, se poate spune ca limfocitele T realizeaza "supraveghere imunologica" permanenta a APC, verificand astfel in mod continuu daca acestea expun sau nu diverse antigene.
Etapa Ag-specifica este ocazionata de prezentarea si recunoasterea antigenica si ea consta in principal in stabilirea de legaturi intre complexul MHC/epitop, prezent pe membrana APC, si TCR/CD4 sau TCR/CD8 de la suprafata LT. In urma stabilirii acestor contacte, sunt ge-nerate 2 categorii de semnale, care se transmit pe calea TCR/CD3 catre profunzimea citoplasmei LT. Primul semnal apare ca urmare a contactului dintre CD4 sau CD8 si domeniul monomorf al moleculelor MHC. Acest semnal se transmite prin CD4 sau CD8 catre PTK p56lck , care - suferind anumite modificari conformationale care intereseaza mai ales centrul catalitic - isi exteriorizeaza tirozina din pozitia 505, care autofosforilandu-se conduce la inhibitia enzimei. Rolul biologic al acestei inhibitii este acela de a abroga sau sista raspunsul LT la contactul lor cu APC, care nu expun antigene, evitandu-se astfel un raspuns fata de propriile molecule MHC. In cazul in care, insa, moleculele MHC prezente pe suprafata APC nu sunt vide sau goale, ci - dimpotriva - ele expun un Ag, recunoasterea acestuia declanseaza un stimul activator, care se transmite catre profunzimea citoplasmei limfocitului T pe calea TCR/CD3, el ajungand in final la CD45 via lanturilor x. Primind acest semnal, CD45 isi valideaza proprietatea de a fi enzima si, comportandu-se ca o protein- tirozinfosfataza (PTP), ea preia fosfatul de pe tirozina 505 a PTK p56lck , care prin defosforilare se activeaza. La randul ei, PTK p56lck odata activata incepe sa fosforileze diverse substrate, printre care si unele enzime, ceea ce - in final - conteaza pentru activare metabolica a LT. Semnalele ajunse la lanturile x sunt transmise si catre ZAP70, care activandu-se preia fosfatul de pe CD45 si il transmite mai departe catre PLC, rezultand activarea en-zimei, moment din care este declansata cascada fosfatidilinozitolilor cu eliberarea de IP3 si DGA.
IP3 fiind o substanta hidrosolubila difuzeaza larg in intreaga citoplasma, ea activand receptorii specifici (IP3-R) de la nivelul reticulului endoplasmic neted, rezultatul fiind eliberarea Ca+2 de la acest nivel si cresterea concentratiei lor intracitozolice - moment central al activarii LT. Titrul crescut al Ca+2 activeaza calcineurina, care - fiind o fosfataza calmodulin-dependenta - activeaza prin defosforilare NF-AT sau factorul nuclear al LT activate. Acest factor patrunzand intranuclear stimuleaza diviziunile mitotice si activeaza intr-o anumita masura genele pentru interleukine.
DAG eliberat cu ocazia activarii PLC, fiind o substanta liposolubila, activeaza mai ales la nivelul membranei celulare, unde activeaza PKC. Aceasta enzima - pe de o parte - fosforileaza diverse seturi de enzime contribuind astfel la activarea metabolismului LT, iar - pe de alta parte -fosforiland inhibitorul NF-kB, activeaza acest factor, care patrunzand intranuclear activeaza (prin intermediul unor mediatori secunzi) atat genele pentru IL2, cat si pentru receptorul acesteia, care este CD25.
Activarea in sens anterograd a limfocitului T presupune, insa, nu numai transmiterea unor semnale pe calea TCR/CD3 (calea principala), ci si pe o cale accesorie, reprezentata de catre CD28. Stimularea CD28 are loc in momentul in care receptorul angajeaza legaturi cu CD80, expus pe membranele tuturor APC profesionale. Semnalele generate sunt transmise catre profuzimea limfocitului T prin segmentele intracitoplasmatice ale CD28 catre un factor transcriptional specific, care in acest caz este CD28-RC (RC - complex receptorial). La randul lui, CD28-RC activat, patrunde intranuclear, unde stimuleaza CD28-RE (RE - element receptor), prin intermediul caruia, ca si al unor mesageri secunzi, sunt - in final - activate majoritatea genelor pentru interleukine.
Rezultatele sumarii tuturor efectelor care decurg in urma activarii LT pe caile TCR/CD3 si CD28 sunt activarea lor metabolica, cresterea numarului lor cu expansiunea clonala si mai ales maturarea functionala, aceste celule devenind producatoare de interleukine sau diversi mediatori cu rol citotoxic sau distructiv.
Cooperarea cognitiva si noncognitiva dintre cele 2 celule se realizeaza, nu ca urmare a unor contacte aleatorii intre receptorii lor de suprafata, ci ea are ca baza polarizarea limfocitului T in raport cu APC la nivel membranar si citoplasmatic si constituirea intre cele 2 celule a ceea ce se numeste sinapsa imunologica sau centrul de activare supramoleculara (SMAC), in cadrul careia aceste legaturi apar intr-o anumita ordine cronologica si prezinta o anumita topografie in cadrul membranelor celulare. Polarizarea LT, aflat in contact cu APC, implica redistributia sistemului de microtubuli si aparatului Golgi intre nucleu si versantul membranar situat catre APC, urmata de concentrarea in aceeasi regiune a principalilor receptori, implicati in recunoasterea antigenica, reprezentati de TCR, CD3, CD4, CD8. Formarea SMAC are loc secundar parcurgerii a 3 stadii distincte. Initial, contactele dintre cele 2 celule se realizeaza prin stabilirea de legaturi prin numeroasele cuplurile de adeziune intercelulara CD2-LFA3 si LFA1-ICAM, la periferia acestora formandu-se putine cupluri MHC/epitop-TCR, care - desi sunt insuficiente pentru initierea activarii LT - ele declanseaza suficiente semnale capabile sa conduca la reorganizarea citoscheletala a LT. Secundar acesteia si intensificarii activarii LT, cuplurile MHC/epitop-TCR incep sa se distribuie catre interiorul zonei de concentrare a cuplurilor de adeziune, pentru ca - in final - acestea sa ocupe in numar din ce in ce mai mare zona centrala a sinapsei imunolo-gice. Aceasta redistributie a moleculelor de suprafata face ca sinapsa sa prezinte urmatoarea topografie: SMAC centrala, in care sunt concentrate cuplurile MHC/epitop-TCR, urmate de moleculele accesorii (CD3, CD4 sau CD8) si principalele proteinkinaze (lck, fyn, PKC etc), SMAC intermediara ocupata de cupluri CD2-LFA3 si SMAC externa sau periferica, in care sunt concentrate cupluri LFA1-ICAM.
Segregarea topografica a moleculelor de suprafata a LT este explicata actualmente prin mai multe mecanisme.
Astfel, o importanta observatie a fost aceea ca segmentele extracelulare ale moleculelor implicate in realizarea acestor sinapse imunologice prezinta dimensiuni extrem de diferite, mergand de la doar 7 nm in cazul TCR si complexului MHC/epitop, la 21 nm in cazul receptorilor de adeziune intercelulara, pana la 43-50 nm, asa cum este cazul segmentelor extramembranare ale CD43 si mai ale CD45. In principiu, se considera ca formarea legaturilor TCR-MHC/epitop si mai ales cresterea numarului acestora, data fiind afinitatea lor crescuta, exclude la periferia zonei de contact cuplurile receptoriale de dimensiuni mari, acestea fiind distribuite in zonele intermediara si periferica a SMAC.
La redistributia topografica a moleculelor de suprafata, mai contribuie si modificarile citoscheletale corticale, care sunt induse secundar activarii actinei locale, acest meca-nism fiind sigur implicat in concentrarea in zona centrala a SMAC a TCR.
In fine, la segregarea topografica a moleculelor de suprafata mai contribuie si faptul daca acestea sunt sau nu ancorate in unitati de flotare (lipid rafts), care sunt microdomenii membranare bogate in glicosfingolipide si colesterol. TCR si moleculele accesorii, asociate acestuia ca CD3, CD4/CD8, lck, fyn, PKC, LAT etc., sunt toate grupate si plasate in centrul unor unitati de flotare, pe cand alte molecule, ca CD45, nu au contacte cu asemenea unitati. Aceasta face ca, pe masura ce se constituie legaturi TCR-MHC/epitop, receptorii neinclavati in membrana prin intermediul unitatilor de flotare sa fie "impinsi" in afara acestor zone (fig.1).

Fig. 1 - Reprezentare schematica a principalelor etape ale activarii anterograde a
limfocitelor T (sus APC) si distributia topografica a cuplurilot receptoriale Ón cele trei zone ale sinapsei imune.


Considerat in ansamblul lui, procesul de segregare moleculara este extrem de important, intrucat - pe de o parte - prin distributia ordonata a acestor molecule se creeaza conditii pentru activarea lor doar intr-o anumita ordine, iar - pe de alta parte - concentrarea lor in arii bine delimitate, dar mari, permite activarea LT pornind de la o suprafata membranara mare, ceea ce creste mult eficienta stimulilor activatori.
TCR, spre deosebire de multi receptori pentru factori de crestere, este un receptor lipsit de activitate enzimatica intrinseca, ceea ce presupune aprioric ca transmiterea unor semnale activatoare pe aceasta cale se realizeaza prin participarea unor factori mesageri secunzi, capabili sa realizeze transductia catre profun-zimea citoplasmei a stimulilor activatori. In aceasta categorie, se inscriu moleculele adaptator, care sunt molecule lipsite de activitate enzimatica sau transcriptionala, dar a caror functie este aceea de a media contactele proteina-proteina prin intermediul diverselor domenii functionale. Cel mai bine cunoscute sunt domeniul 2 de omologie src (SH2) si domeniul de legare al fosfotirozinei (PTB), ambele contactand secvente de recunoastere bogate in radicali de fosfotirozina, SH3 care recunoaste secvente proteice bogate in prolina, PH sau domeniul de omologie cu pleckstrina, care mediaza contactele cu fosfolipidele. In plus, moleculele adaptator contin numeroase secvente fosforiltirozinice sau prolinice, care - la randul lor - sunt recunoscute de catre domenii de legare complementare si-tuate pe diverse proteine. Este de mentionat faptul ca - si aceasta creste mult interesul pentru aceasta categorie de molecule - studii foarte recente au aratat ca moleculele adaptator functioneaza ca regulatori atat pozitivi, dar si negativi, ai transductiei semnalelor de suprafata.
Grb2 (growth factor receptor binding protein 2) este un mic polipeptid prezent ubicuitar, care contine un domeniu central SH2, flancat de 2 domenii SH3. Prin domeniul lui SH2, Grb2 se ataseaza resturilor fosfotirozinice de la nivelul segmentului intracitoplasmatic al receptorilor tirozinkinazici (RTK). Prin domeniile lui SH3, Grb2 angajeaza legaturi cu o scurta secventa de aminoacizi foarte bogata in prolina a Sos (son of sevenless), care este un important factor de schimb nucleotid guanidinic (GEF - guanine nucleotide exchange factor). Grb2 legat la tirozinele fosforilate ale RTK indeplineste 2 functii distincte: fixeaza Sos la nivel membranar undeva in stricta vecinatate a receptorului, si activeaza Sos, ceea ce sti-muleaza disocierea ras-GDP, inlocuirea GDP ® GTP cu activarea ras si a intregului lant subsecvent: MAP kinaz-kinaz kinaza, reprezentata in principal de catre proteina raf, MAP kinaz-kinaza sau proteina Mek si MAP kinaza numita si Erk (fig 2).

Fig. 2 - Reprezentare schematica a principalelor molecule adaptator implicate Ón activarea limfocitelor T


Trebuie mentionat ca nu toti receptorii celulari au capacitatea de a fixa heterodimerul Grb2/Sos. O exceptie importanta o reprezinta limfocitele, in cazul carora, desi initial s-a presupus ca Grb2/Sos se leaga la lantul z al CD3 al limfocitului T sau la segmentele intracitoplasmatice ale Iga si Igb (limfocit B), indirect prin intermediul unei alte proteine adaptor numita Shc, aceasta ipoteza nu a fost niciodata confirmata experimental. Actualmente, este bine dovedit ca, secundar activarii limfocitare, heterodimerul Grb2/Sos este legat si respectiv concentrat la nivel membranar in complex cu LAT sau linker of activated T cells.
Din clasa moleculelor adaptor Grb2, fac parte inca 2 componente, reprezentate de catre Grap si Gads.
Grap (Grb2 - like accessory protein) are o structura si o functie foarte apropiata Grb2, ea fiind constituita dintr-un domeniu central SH2, dispus intre 2 domenii SH3.
Gads (Grb2- related adapter downstream of Shc) are aproape aceeasi structura ca cea mentionata mai sus, cu diferenta ca intre domeniul central SH2 si domeniul SH3 C-terminal se interpune o secventa extrem de bogata in prolina. Grap si Gads sunt exprimate in exclusivitate in celulele de origina hematogena, iar din acestea Gads este prezent numai in macrofage, celulele NK, limfocitele T. Moleculele Grap au o afinitate crescuta pentru Sos, Shc, PLCg si LAT, pe cand Gads nu leaga Sos, ci prezinta afinitate pentru LAT, Shc, tirozina fosforilata a fosfatazei SHP-2 si molecula adaptor SLP-76.
Interactiunea Grb2/Shp2-Sos este controlata de 2 mo-lecule adaptor cu functie inhibitorie, reprezentate de catre Cbl si SAP.
Cbl este o fosfoproteina cu rol de molecula adaptor, activata prin fosforilare de catre PTK src si syk, ca urmare a activarii BCR/TCR. Functia Cbl este aceea de a impie-dica stabilirea unor contacte intamplatoare intre Grb2 si Sos, atata timp cat celula nu este activata. Inhibitia acestei asocieri se realizeaza ca urmare a interactiunii Cbl cu domeniul SH3 al Grb2, prin care se realizeaza exclu-derea competitiva a Sos de la contactul cu Grb2 si impiedica totodata Sos sa vina in contact cu substratul lui reprezentat de Ras. Ca urmare a sti-mularii antigenice si a fosforilarii tirozinei de catre PTK, Cbl interactioneaza cu domeniul SH2 atat al IP3-kinazei, cat si al Crk, ceea ce favorizeaza disocierea Cbl-Grb2.
SAP (SLAM - associated protein) este o mica molecula adaptor, care contine un domeniu SH2, prin intermediul caruia molecula interactioneaza cu fosfotirozinele prezente in segmentul intracitoplasmatic al SLAM (signaling lymphocyte-activation molecule), prezenta pe membrana atat a limfocitului T, cat si cea a limfocitului B. Aceasta interactiune inhiba atasarea Shp2 la SLAM.
SLP-76 este o alta proteina adaptor, care prezinta numeroase resturi de tirozina spre capatul ei N-terminal, un domeniu SH2 la capatul ei C-terminal, iar in segmentul central prezinta o secventa aminoacidica foarte bogata in prolina. Proteina SLP-76 este exprimata de catre marea majoritate a celulelor de origine hematogena, exceptie facand insa limfocitele B, care exprima in schimb un omolog functional notat cu indicativul de BLNK (B cell linker protein). In limfocitele T, secundar stimularii TCR, SLP-76 este activata prin fosforilare de catre ZAP-70. Fosforilarea are loc la nivelul tirozinelor 113 si 128, dispuse catre capatul N-terminal al proteinei, ea crescand semnificativ capacitatea SLP-76 de a angaja legaturi cu domeniul SH2 al protooncogenei vav, care activandu-se fixeaza Nck, care este un adaptor molecular ce leaga vav de Pak (p21 activated kinase), aceasta din urma fiind implicata in polimerizarea actinei si capping-ul receptorilor de suprafata, care apare secundar stimularii TCR. In plus, SLP-76 se poate concentra la nivelul membranei, unde angajeaza legaturi cu LAT, ceea ce conduce nu numai la stimularea caii Grb2/Sos/Ras, ci si la activarea PLCg1. Rezulta ca, in cazul limfocitului T, SLP-76 este deci un punct nodal cu tripla importanta: mediaza polimerizarea actinei F, activeaza calea ras, stimuleaza cresterea concentratiei intracitozolice de Ca.
Corespondentul limfocitar B al SLP-76 este SLP-65, cunoscut si sub denumirea alternativa de BASH (B cell adapter containing SH2 domain). In principiu, BASH are o structura relativ asemanatoare SLP-76 (gradul de omologie a secventelor de aminoacizi nu depaseste 30%), este tirozinfosforilata, secundar stimularii BCR, si interac-tioneaza specific cu PLCg2, ea angajand legaturi si cu PLCg1, vav, Nck.
O alta molecula, care interactioneaza cu SLP-76, este SLAP-130 (SLP-76 associated phosphoprotein of 130kDa), care mai este cunoscuta si sub numele de Fyb (Fyn - binding protein). Molecula contine o regiune foarte bogata in prolina, un domeniu SH2 dispus catre capatul ei C-terminal. si numeroase resturi de tirozina care pot fi fosforilate secundar activarii TCR, mai precis de catre PTKsrc de tip fyn. Aceasta fosforilare este extrem de importanta pentru interactiunea SLAP-130/Fyb cu domeniul SH2 al SLP-76; aceasta interactiune este detectabila timp de 24 de ore de la declansarea stimularii limfocitelor T.
Alte tipuri de molecule adaptor, care interactioneaza cu SLAP-130/Fyb, sunt SKAP55 (Src kinase-associated phosphoprotein of 55kDa), SKAP 55 Hom (SKAP 55 homologue) si SKAP-55R (SKAP-55 related protein). SLAP-130/Fyb interactioneaza cu proteinele SKAP, angajand legaturi la nivelul domeniilor SH3 ale acestora. In limfocitele T, aflate in stare de repaus, SKAP-55 se asociaza constitutiv cu fyn, si intrucat complexul este disociat doar cu ocazia activarii celulare, se sustine - fara ca acesta sa fie un aspect speculativ - ca SKAP-55 si SLAP-130/Fyb sunt implicati in cuplarea functionala a fyn la SLP-76. Desi exista o serie de incertitudini cu privire la rolul SLAP-130/Fyb, studiile efectuate pe celule din linia Jurkat, acrediteaza tot mai mult ideea ca functia majora a SLAP 130/Fyb este aceea de inhibitie a semnalelor SLP-76-dependente si de inhibitie a activarii promotorului IL2 indusa de TCR.
___________________________
Bibliografie SELECTIVA

Van der Merwe PA, Davis S, Shaw A, Dustin M - Sem Immunol, 2000, Vol. 12, pag. 5 - 22.
Janes P, Ley S, Magee A, Kabouridis P - Sem Immunol, 2000, vol 12, pag 23 - 35.
Norian L, Koretsky G - Sem Immunol, 2000, vol 12, pag 43 - 55.
Clements JL, Ross-Barta SE, Tygrett LT, Waldschmidt TJ, Koretsky G - J Immunol, 1998, 161, pag 3880 - 3889.
Bara C - Esential de imunologie, Ed. All, 2002, pag. 29 - 33.