Activitatea mediata oxidativ a fosfolipazei A2

Maria Mohora*

Relatia dintre activitatea fosfolipazei A2 (PLA2) si structura membranei

Una dintre modalitatile de organizare a fosfolipidelor in membrane este forma de bistrat dublu lipidic. S-a constatat ca, organizate in strat dublu lipidic, fosfolipidele sunt mai stabile la actiunea PLA2. sPLA2 manifesta preferinta pentru fosfatidiletanolamina si fosfolipide anionice, cum ar fi fosfatidilserina si fosfatidilglicerolul (abundente in membranele bacteriene). Enzima are activitate mica asupra fosfatidilcolinei. Fata externa a membranei plasmatice este bogata in fosfolipide cu colina (sfingomieline si fosfatidilcoline), substraturile pentru sPLA2 fiind localizate pe fata interna a membranelor. sPLA2 are o actiune redusa asupra membranelor celulare intacte. Pentru ca sPLA2 sa actioneze asupra membranei, este necesara o perturbare a asimetriei sau o rea-ranjare a fosfolipidelor membranare.
O caracteristica generala a celulelor eucariote este asimetria fosfolipidica, asigurata de o aminofosfolipid translocaza sau flipaza, care poseda caracteristicile unei ATP-aze membranare. In anumite conditii, se poate pierde asimetria, cum este cazul plachetelor tratate simultan cu trombina si colagen, celulelor endoteliale si plachetelor supuse actiunii perforinelor (complexul de atac membranar al complementului) sau celulelor in apoptoza (1). S-a constatat ca sPLA2 actioneaza preferential asupra microveziculelor emise de celulele, care si-au pierdut asimetria fosfolipidica, ca urmare a fluxului rapid al fosfolipidelor de pe fata interna a membranei catre fata externa, flux compensat ulterior printr-o echilibrare intre cele 2 fete.
Semnalele biochimice, care determina perturbarea membranei, nu sunt in totalitate cunoscute. Fourcade si colab. (2) au sugerat ca pierderea asimetriei, din cauza mecanismului flip-flop al fosfolipidelor, poate fi unul dintre aceste semnale. S-a demonstrat ca acumularea de diacilglicerol sau ceramida perturba impachetarea membranei plasmatice, favorizand actiunea PLA2. De asemenea, cresterea concentratiei acidului arahidonic in celule marcate, prin adaugare de acid arahidonic exogen nemarcat (mimand astfel activarea cPLA2), duce la eliberarea de acid arahidonic marcat, ca urmare a actiunii sPLA2. Aceste rezultate sugereaza ca activarea cPLA2 poate fi un eveniment-cheie, care duce la perturbarea membranei, facand-o susceptibila la atacul sPLA2.

Efectul peroxidarii lipidice asupra structurii membranei

Studii efectuate pe membrane artificiale, precum si pe membrane biologice, au dus la concluzia ca modificarea structurii acestora, ca urmare a oxidarii fosfolipidelor, le face susceptibile la actiunea sPLA2 (3). Peroxidarea lipidelor membranare, produsa de radicalii liberi ai oxigenului, conduce la formarea hidroperoxizilor ca primi produsi. Hidroperoxizii genereaza forme reactive, care influenteaza activitatea unor proteine si modifica proprietatile fizice ale membranelor, prin schimbarea orientarii fosfolipidelor si a dinamicii acestora. Aceasta alterare a structurii membranelor pare sa fie suficienta pentru activarea fosfolipazelor extracelulare. Hidroliza fosfolipidelor se produce rapid, dupa tratamentul celulelor sau membranelor artificiale cu oxidanti.
Degradarea membranelor, ca urmare a oxidarii fosfolipidelor, pare analoga actiunii detergente a sarurilor bi-liare, care maresc activitatea hidrolitica, prin transformarea bistraturilor fosfolipidice in micelii. Formarea de fosfolipide oxidate printre fosfolipidele neoxidate ale unui bistrat lipidic determina agregarea acizilor grasi si aparitia unor domenii cu densitate mare de sarcina negativa la care adera PLA2, urmata de modificarea conformationala si activarea centrului activ al enzimei. Suplimentar, produsii de peroxidare din membrane induc formarea de pori, comportarea ca ionofori sau scaderea activitatii pompelor ionice, avand ca rezultat influxul de calciu extracelular sau eliberarea calciului din depozite care activeaza PLA2.
Recunoasterea imperfectiunilor structurale membranare de catre toate tipurile de PLA2 sugereaza faptul ca enzimele asociate celulei pot juca un rol in minimalizarea formarii domeniilor heterogene prin indepartarea lipidelor degradate. Domeniul oxidat permite legarea ionilor de calciu la interfata, iar lasoul de legare a Ca2+ inconjoara centrul catalitiv al enzimelor Ca2+-dependente. Studii recente considera plauzibil rolul PLA2 de antioxidant indirect, avand in vedere capacitatea acesteia de a mentine lipidele modificate oxidativ la un nivel care nu permite propagarea autocatalitica a reactiilor de oxidare. Aceasta relatie ar putea sa sublinieze un rol important pentru PLA2 in micsorarea peroxidarii lipidice, prin limitarea cantitatii de peroxizi lipidici, care se pot acumula in membrane.

Reglarea activitatii PLA2 prin ionii de Ca2+

Deteriorarea membranei prin peroxidarea lipidica perturba homeostazia calciului, care este un semnal initial important pentru activarea PLA2 (4). Pentru multe dintre tipurile de PLA2, activarea pare sa fie secundara cresterii Ca2+ intracelular si/sau Ca2+ asociat la membrane. Aceasta activare poate fi atribuita reorganizarii fosfolipidelor indusa de Ca2+, care presupune formarea unor interfete, caracterizate prin cresterea activitatii hidrolitice a enzimei. Fosfolipidele cu grupari anionice coordineaza Ca2+ aducand astfel PLA2 cu centrul activ in apropierea legaturii esterice sn-2. Formarea unor produsi secundari polari in cursul peroxidarii lipidice, cum ar fi gruparile carbonil, ar furniza grupari capabile sa lege Ca2+. De notat ca activitatea catalitica poate fi sustinuta si de alti cationi bivalenti si chiar de concentratii mari de saruri, dar cel mai efficient la concentratii intracelulare normale ramane Ca2+.
Activitatea PLA2 secretoare, cu masa moleculara mica, este dependenta de Ca2+. Coordinarea Ca2+ in proximitatea centrului activ este necesara atat pentru activitatea catalitica a enzimei, cat si pentru legarea enzimei la substrat.
cPLA2 intracelulara dependenta de Ca2+ este transfe-rata din citosol la membrana la concentratii de calciu cuprinse intre 300 nM si 10 mM, activarea ei fiind rezultatul activarii altor cai de semnalizare, cum ar fi cea mediata de proteine G. Ca2+ este necesar, dar nu suficient pentru activarea deplina, prin diferiti stimuli, a PLA2 intracelulara Ca2+-dependenta. Cresterea calciului intracelular este influentata de gradul modificarii oxidative a membranei.
In cazul PLA2 Ca2+-independente, aparent, Ca2+ nu este necesar pentru legarea enzimei la membrane sau pentru cataliza, indicand o particularitate structurala a en-zimei, care o face activa pentru substraturi micelare si nu pentru substraturi anionice. S-a constatat ca lipidele peroxidate pot fi substraturi pentru PLA2 Ca2+-independente, care elibereaza acizii grasi peroxidati. Tipul de cPLA2 -Ca2+- independenta, selectiva pentru plasmalogeni, predomina in sarcolema; enzima are afinitate pentru plasmenil- si fosfatidilcolinele din membrane si pentru fosfolipidele oxidate din miocard. S-a constatat, de asemenea, ca oxidantii produsi in procesul de ischemie/reperfuzie sau inflamatie ataca rapid legaturile vinil-eter din plasmalogeni, formand produsi de oxidare, care sunt substraturi excelente pentru PLA2 Ca2+-independente. La o concluzie similara s-a ajuns, utilizand preparate din plamanul si ficatul sobolanilor cu dieta deficitara in seleniu si vitamina E. S-a inregistrat o crestere marcanta a produsilor de peroxidare lipidica, acompaniata activitatii PLA2 Ca2+-independente, in timp ce PLA2 Ca2+ dependenta a fost foarte putin afectata.

Reglarea activitatii cPLA2 prin fosforilare

cPLA2 contine numeroase resturi aminoacidice, care sunt substraturi pentru Tyr si Ser/Thr kinaze, dintre care cel mai important pentru activarea enzimei, in vivo, este Ser505, care poate fi fosforilata de catre proteinkinaze activate de stimuli mitogeni (MAP kinaze), in timp ce fosforilarea cPLA2 in regiunea C-terminala este necesara pentru ancorarea la membrana. Cu toate ca fosforilarea Ser505 este importanta pentru activarea cPLA2, in unele celule ea nu este suficienta pentru activarea totala, avand ca rezultat eliberarea acidului arahidonic. In macrofage, CSF1 (colony-stimulating factor) activeaza MAP kinazele p42/p44, inducand fosforilarea si cresterea activitatii cPLA2. Cu toate acestea, CSF1 in sine nu induce eliberarea acidului arahidonic, dar actioneaza sinergic cu agonistii care mobilizeaza calciu. Aceasta sugereaza ca procesele de fosforilare, impreuna cu ancorarea cPLA2 la membrane, mediata de calciu, pot actiona sinergic pentru activarea completa a cPLA2, care hidrolizeaza fosfolipidele cu eliberarea acidului arahidonic. Este interesant de retinut ca, pentru activarea completa a enzimei si eliberarea acidului arahidonic in celulele HER 14, fosforilarea cPLA2 trebuie sa preceada cresterea calciului intracelular, ceea ce sugereaza ca cPLA2 nu poate fi disponibila pentru fosforilare, daca ea este mai intai ancorata la membrana.
S-a mentionat rolul PKC (proteinkinaza C) in activarea cPLA2 si reglarea eliberarii acidului arahidonic. PKC activeaza o cascada de kinaze, care duc la activarea MAPK (5). Gopalakrishna si Anderson (6) au constatat ca adaugarea de H2O2 modifica proprietatile cinetice ale PKC la o izoforma care este independenta de Ca2+/fosfolipide. Activarea ar avea loc prin oxidarea directa a unei grupari tiolice specifice din domeniul reglator al PKC, care influenteaza activarea/inactivarea reversibila a enzimei.
Interactiunile PKC cu membranele peroxidate duc la cresterea activitatii kinazice a PKC. Evenimentele-cheie constau in: fosforilare, translocare si activare hidrolitica a PLA2, desi nu sunt excluse etape de fosforilare, implicand kinaze cum ar fi raf, MEK si ERK (MAP kinaze), (ultimele determina cea mai mare activare prin fosforilare a cPKC). In fig.1, sunt sugerate momentele la care oxidantii (in particular peroxizii lipidici si produsii derivati) pot stimula componentii cascadei kinazice, ducand la fosforilarea PLA2. Interreactia oxidantilor cu MAP kinaz kinazele sau MAP kinazele (urmata de fosforilarea completa si stimularea activitatii hidrolitice a cPLA2) nu este exclusa.

Fig. 1 - Reglarea activitatii cPLA2. Factorii de crestere (EGF, PDGF etc.) provoaca dimerizarea receptorilor specifici si autofosforilarea. Aceasta permite activarea fosfolipazei Cy, care hidrolizeaza fosfatidilinozitol 4,5-bifosfatul, provocand eliberarea calciului din reticulul endoplasmic prin intermediul IP3. Cresterea calciului favorizeaza interreactia enzimei cu fosfolipidele membranei. MAPK sunt activate printr-o cascada care presupune interventia Raf. Receptorii cuplati cu proteine Gq activeaza fosfolipaza C-beta, care favorizeaza eliberarea DAG si activarea proteinkinazei C (PKC). PKC poate activa direct cPLA2 prin fosforilare sau prin intermediul MAPK. Dupa activarea prin fosforilare, cPLA2 migreaza la membrana sub influenta ionilor de calciu (1).

Prin rolul ei antioxidant, vitamina E ar putea inhiba peroxidarea lipidica, dar pot fi luate in consideratie si alte actiuni posibile ale acesteia, care includ inhibitia directa a activitatii PKC sau a translocarii ei, ca si inhibitia directa a PLA2. Acizii grasi nesaturati, cum ar fi acidul arahido-nic, pot de asemenea activa direct PKC, sau participa la evenimente mediate de PKC, cum ar fi exprimarea c-fos in timpul stimularii oxidative a cresterii celulare, care necesita eliberarea acidului arahidonic dependenta de PLA2 si metabolizarea lui pe calea lipooxigenazei-monooxigenazei P-450.
Studiile efectuate pe fragmente de PLA2 pura au aratat ca PKC si P42-MAP-kinaza actioneaza in zone diferite de fosforilare, pentru activarea enzimei fiind necesare mai multe fosforilari. Aceste fosforilari, impreuna cu legarea la membrana, mediata de Ca, par sa stimuleze coordonat hidroliza fosfolipidelor, cu eliberarea acidului arahidonic. Reglarea activitatii PLA2 de catre PKC, prin intermediul unor kinaze situate in aval, care fosforileaza direct PLA2 (de ex. MAP kinaze), este argumentata de suprimarea completa a acivitatii hidrolitice a PLA2 indusa de agonist (indusa de peroxid) de catre inhibitorii PKC.
S-a constatat ca familia MAP kinazelor este stimulata ca raspuns la oxidanti: expunerea celulelor la hidroperoxizii acidului linoleic, radiatii X, tratarea cu H2O2 si depletia de glutation. Activarea p42 MAP kinazelor necesita fosforilarea a doua rezidii Thr 183 si Tyr 185, cata-lizate de MAP kinaz kinaze, care par de asemenea sa fie modulate de oxidanti. Oxidantii activeaza aceste kinaze, fie prin stimularea fosforilarii, fie prin inhibitia enzimelor defosforilarii. Agentii oxidanti inhiba tirozinfosfataza. Deoarece toate tirozinfosfatazele au rezidii de cisteina in centrul activ, inhibitia lor ar putea fi determinata de oxidarea acestora, fapt ce ar justifica fosforilarea tirozinei. Guy si colab. (7) sugereaza ca fosforilarea indusa de oxidanti se datoreaza inactivarii unei proteinfosfataze redox sensibile. O astfel de inactivare este compatibila cu o activare stimulata prin fosforilare, cum este cea catalizata de PKC.

Rolul iPLA2 in remodelarea fosfolipidelor membranare

Hidroliza fosfolipidelor oxidate de catre PLA2 are 2 efecte semnificative: metabolizarea si eliminarea acizilor grasi eliberati si atenuarea deteriorarii membranei prin repararea fosfolipidului oxidat. Hidroperoxizii formati sunt redusi la alcooli de glutationperoxidaze (GPx) seleniu-dependente citosolice si membranare. Actiunea concertata a PLA2 si a GPx duce la eliminarea peroxizilor lipidici prooxidanti, lizofosfolipidele rezultate fiind utilizate pentru reparare in prezenta unor enzime de reacilare. In stressul oxidativ sever sau ischemia prelungita, creste peroxidarea lipidica, iar incorporarea acizilor grasi in fosfolipide nu tine pasul cu hidroliza, chiar daca activitatea hidrolitica nu este apreciabil crescuta. Antioxidanti, ca acidul nordihidroguaiaretic si ascorbatul, protejaza celulele de actiunea peroxidarii lipidice si inhiba activitatea PLA2.
Ciclul de deacilare/reacilare a fosfolipidelor membranare-ciclul Lands-(un fosfolipid este hidrolizat de catre o PLA2 intracelulara, cu generarea unui 2-lizofosfolipid, care poate fi reacilat cu diversi acil-CoA) este un ciclu de remodelare, constituind calea majora de incorporare a acidului arahidonic liber in fosfolipidele celulare la concentratii nM ale acidului gras liber (fig. 2).

Fig. 2 - Incorporarea de novo si remodelarea acizilor grasi liberi in membrane. In calea de novo, acizii grasi liberi furnizati celulei sau eliberati de fosfolipazele endogene sunt incorporati via acil-CoA in glicerolfosfat sau dihidroxiacetonfosfat si in acidul lizofosfatidic de catre o acil-CoA aciltransferaza cu formarea acidului fosfatidic. In celulele mamiferelor, acidul fosfatidic poate fi transformat in fosfatidilinozitol sau poate fi transformat in diacilglicerol, precursorul fosfatidilcolinei si fosfatidiletanolaminei, care poate forma fosfatidilserina. In contrast, in calea de remodelare, fosfolipidele preexistente sunt transformate in lizofosfolipide sub actiunea iPLA2, acestea putand fi reacilate de catre acil-transferaze prin utilizarea acil-CoA.

Calea de novo - calea Kennedy - constituie a doua solutie pentru incorporarea acidului arahidonic in fosfolipidele celulare, relevanta numai la concentratii micromolare ale acestuia. Astfel, incorporarea acidului arahidonic in fosfolipide, in conditii normale, este dependenta de activitatea PLA2, care genereaza 2-lizofosfolipidul utilizat in reactia de acilare.
Macrofagele si linia celulara a macrofagelor poseda o capacitate mare de incorporare a acidului arahidonic in fosfolipidele membranare. Acest proces este independent de Ca2+ sugerand implicarea iPLA2. In remodelarea fosfolipidelor in celulele in nondiviziune (resting conditions) este implicata iPLA2 tipul VI. Aceasta enzima pare sa regleze calea principala, prin care celulele incorporeaza acid arahidonic si alti acizi nesaturati in fosfolipidele membranare. Viteza de incorporare a acidului arahidonic in fosfolipide determina, de asemenea, cantitatea de acid gras liber disponibila in celulele in nondiviziune, acidul arahidonic liber fiind un factor limitant pentru biosinteza eicosanoizilor. Deoarece reactia mediata de iPLA2 precede actiunea transacilazei CoA-independente, este posibil ca iPLA2 sa determine distributia subcelulara a acestui acid gras in diferite compartimente celulare, ca si cantitatea re-lativa de acid gras prezenta in fiecare compartiment, inainte ca reactia ulterioara, de remodelare, catalizata de transacilaza CoA-independenta, sa aiba loc.

Concluzii

Peroxidarea lipidelor membranare poate induce activarea PLA2 prin 2 procese interdependente. Primul proces este Ca2+-dependent si este mediat de evenimente-semnal, care au originea la nivelul membranei plasmatice (sau membranelor intracelulare), si presupun participarea proteinelor transductoare ale semnalelor si mesagerilor derivati din membrane. Aceste procese se pot produce la concentratii mici de calciu, in particular acolo unde are loc oxidarea gruparilor -SH reglatoare sau unde este amplificata legarea Ca2+. Al doilea proces este Ca2+-independent si este mediat de procese fiziologice aberante determinate de stresul oxidativ.
In conditiile in care nu se produce o degradare severa a membranelor si o pierdere excesiva de calciu, deteriorarile structurale induse de peroxizi pot mari susceptibilitatea fosfolipidelor membranare la hidroliza la concentratii forte mici de calciu. cPLA2 citosolica, cu masa moleculara mare, prezenta in cateva tipuri de celule, poate fi activata astfel, deoarece necesita pentru activare totala concentratii mM de Ca2+. Stimularea cPLA2 mediata de peroxizi implica activarea PKC, care activeaza o cascada de kinaze. Desi activarea cPLA2 depinde de PKC, cercetari recente nu exclud implicarea tirozin kinazelor (8). Identificarea sistemelor enzimatice de fosforilare reglate de oxidanti, care stimuleaza activitatea PLA2, demonstreaza rolul intrinsec al speciilor reactive ale oxigenului in producerea eicosanoizilor si turnoverul fosfolipidelor.

Partea I a articolului a aparut in nr. 12/2001 al revistei.

_______________
BIBLIOGRAFIE
1. Fourcade O, Simon MF si colab. - Phospholipases A2 et pathologie inflammatoire: consensus et nouveaux concepts, Synthese, 12, 323-332, 1995.
2. Fourcade O, Simon MF si colab. - Secretory phospholipase A2 generates de novel lipid mediator lysophosphatidic acid in membrane microvesicles shed from activated cells, Cell, 80, 919-27, 1995.
3. Nigam S, T Schewe - Phospholipase A2s and lipid peroxidation, Molecular and Cell Biology of Lipids, p 167-181, 1488, 2000.
4. Elliott SJ, Meszaros G, Schilling WP - Effect of oxidant stress on calcium signaling in vascular endothelial cells, Free Rad Biol Med, 13, 635-650, 1992.
5. Leslie CC - Properties and regulation of cytosolic phospholipase A2, J Biol Chem, 272, 16709-16712, 1997.
6. Gopalakrishna R, Anderson B - Ca2+-and phospholipid-independent activation of protein kinase C by selective oxidative modification of the regulatory domain, Proc Natl Acad Sci USA 86, 6758-6762,1989.
7. Guy GR, Cairns J, Ng S, Tan YH - Inactivation of a redox-sensitive protein phosphatase during the early events of tumor necrosis factor/interleukin-1 signal transduction. J Biol Chem, 268, 2141-2148, 1993.
8. Glaser KB, Sung A si colab. - Regulation of eicosanoid biosynthesis in the macrophage. Involvement of protein tyrosine phosphorylation and modulation by selective protein tyrosine kinase inhibitors. Biochem Pharmacol, 45, 711-717, 1993.